Kromatografi (Bagian 1)

Pengertian kromatografi menyangkut metode pemisahan yang didasarkan atas diferensial komponen sampel di antara dua fasa. Menurut pengertian ini kromatografi selalu melibatkan dua fasa, yaitu fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase). Fasa diam dapat berupa padatan atau cairan yang terikat pada permukaan padatan (kertas atau adsorben), sedangkan fasa gerak dapat berupa cairan disebut eluen atau pelarut , atau gas pembawa yang inert. Gerakan fasa gerak ini mengakibatkan terjadinya migrasi differensial komponen-komponen dalam sampel.
Dalam proses kromatografi  selalu terdapat salah satu kecenderungan sebagai berikut :

1. Kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut dalam cairan
2. Kecenderungan molekul-molekul untuk melarut dalam permukaan padatan halus (adsorpsi=penyerapan)
3. Kecenderungan molekul-molekul komponen untuk bereaksi secara kimia (penukar ion)

Komponen yang dipisahkan harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk berinteraksi dengan fasa diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsorpsi, atau bereaksi secara kimia (penukar ion). Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel.
Hasil pemisahan dapat digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif), penetapan kadar(analisis kuantitatif), dan pemurnian suatu senyawa (pekerjaan preparatif) .

Jenis-jenis kromatografi

1.  Kromatografi kolom

Merupakan teknik kromatoghrafi yang paling awal ditemukan, dan merupakan kromatografi serapan atau adsorpsi. Kromatografi ini digolongkan ke dalam kromatografi cair padat(KCP) kolom terbuka :

peralatan utama kromatografi kolom sederhana adalah kolom dan penampung eluen. kolom umumnya terbuat dari pipa kaca dengan ukuran bervariasi tergantung keperluannya. umumnya panjang kolom 10x diameter pipa yang digunakan. kolom dilengkapi dengan kran untuk mengatur aliran pelarut. di atas kran dipasang wol kaca ( glass wool) untuk menahan fasa diam.fasa diam berupa adsorben yang tidak boleh larut dalam fasa gerak, ukuran partikelnya harus seragam. zat pengotor yang terdapat pada fasa diam dapat menyebabkan adsorpsi tidak reversibel. sebagai fasa diam dapat digunakan alumina , silika gel, arang, bauksit, magnesium karbonat, kalsium karbonat, pati,selulosa, gula, dan tanah diatome. pengaliran fasa diam ke dalam kolom dapat dilakukan dengan cara kering dan cara basah. dalam cara basah fasa diam diubah dulu menjadi bubur lumpur (slurry) , dengan pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak, kemudian baru diisikan ke dalam kolom.fasa gerak pada kromatografi kolom dapat berupa pelarut tunggal atau campuran beberapa pelarut dengan komposisi tertentu. pelarut dapat merupakan pelarut polar dan pelarut non polar. umumnya senyawa non polar dengan berat molekul kecil lebih cepat meninggalkan fasa diam.
Dalam pelaksanaannya, pertama-tama sampel yang akan dipisahkan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai . sampel ini kemudian diletakkan di bagian atas kolom yang sudah berisi fasa diam (adsorben). fasa gerak kemudian dialirkan pelan-pelan dan dibiarkan mengalir melalui kolom tersebut. pada saat fasa gerak mengalir sepanjang kolom, fasa gerak akan membawa campuran komponen ke bawah. kesetimbangan dinamis anatara komponen yamg teradsorpsi pada fasa diam dengan komponen yang terlarut dalam fasa gerak akan terjadi selama fasa gerak mengalir ke bawah tadi. tetapan kesetimbangannya disebut koefisien distribusi karena setiap komponen dalam campuran mempunyai koefisien distribusi yang berbeda, maka kecepatan migrasinya juga berbeda. perbedaaan kecepatan migrasi inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan komponen-komponen dalam campuran. komponen yang terpisah tampak sebagai pita-pita dalam fasa diam yang selanjutnya masing-masing pita dapat didorong keluar kolom dengan penambahan fasa gerak, lalu ditampung, dipisahkan , dan diidentifikasi.
Pemisahan dengan metode ini merupakan metode pemisahan yang baik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar ( lebih dari 1 gram).

2. kromatografi kertas

Kromatografi kertas merupakan bentuk kromatografi yang paling sederhana , mudah dan murah. Banyak digunakan untuk identifikasi kualitatif . penemunya adalah Martri , Consden dan Gordon.
Fasa diam dalam kromatografi ini berupa air yang terikat pada selulosa kertas sedangkan fasa geraknya berupa pelarut organic nonpolar. Berdasarkan kedua hal itu kromatografi kertas dapat digolongkan ke dalam kromatografi partisi. Dalam kromatografi kertas fasa gerak merembes ke dalam kertas karena efek kapiler. Rembesan fasa gerak pada kertas dapat dilakukan dengan teknik menaik ( ascending ) atau dengan teknik menurun (descending) . pada teknik menaik rembesan fasa bergerak kea as sedangkan pada pada tekik menurun rembesan fasa gerak bergerak ke bawah. Pada teknik menurun fasa gerak disamping bergerak karena efek kapiler juga dibantu oleh efek gravitasi sehingga rembesan berjalan lebih cepat.

Pelaksanaan teknik ini terbagi pada 3 tahap , yaitu :

1. Penotolan cuplikan
2. Tahp pengembangan
3. Identifikasi atau penampakan noda.

Pada tahap penotolan cuplikan, prertama-tama siapkan kertas kromatografi dengan ukuran tertentu . buatlah garis awal dengan jarak 2-3 cm dengan salah satu ujung kertas dengan menggunakan pensil ( karena pensil terdiri dari satu komponen yaitu kabon sehingga tidak mengganggu migrasi dan pemisahan komponen sampel). Selanjutnya totolkan larutan cuplikan dengan menggunakan mikropipet atau pipa kapiler pada garis awal tadi, kemudian keringkan.
Pada tahap pengembangan, ujung kertas kromatogram dekat garis awal berisi totolan cuplikan dicelupkan ke dalam pelarut ( eluen ) yang terdapat di dalm bejana kromatografi . pencelupan diusahakan tidak merendam totolan cuplikan atau garis awal. Biarkan eluen merembes melalui totolan cuplikan. Komponen-komponen cuplikan akan terbawa oleh rembesan cuplikan. Perbedaan kelarutan komponen-komponen cuplikan dalam eluen akan mengakibatkan kecepatan bergerak komponen-komponen dalam kertas juga berbeda. Perbedaan kecepatan bergerak komponen-komponen ini lebih umum disebut migrasi diferensial. Hasil pemisahan akan Nampak sebagai noda-noda berwarna pada kertas dengan jarak yang berbeda-beda dari garis awal. Noda-noda ini selanjutnya disebut sebagai kromatogram. Perembesan eluen dihentikan setelah eluen hamper mencapai ujung kertas. Pekerjaan selanjutnya adalah member tanda batas gerakan eluen, dan kemudian kertas diangkat dari cairan pengelusi untuk seterusnya dikeringkan.
Pada tahap identifikasi atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf nya. Besaran ini (kependekan dari rate of flow) menyatakan derajat retensi atau factor refensi. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh eluen (fasa gerak).
Rf= jarak yang ditempuh komponen/jarak yang ditempuh eluen
Setiap komponen mempunyai harga Rf sendiri-sendiri. Bila noda tidak berwarna dapat dilakukan hal-hal sebagai berikut:

1. Menyemprot kertas dengan pereaksi penimbul warna seperti ditizon, ninhidrin, kalium kromat, ammonium sulfide dll.
2. Menyinari kertas dengan sinar ultraviolet
3. Mendedahkan kertas pada uap iodium

Barulah harga Rf nya ditentukan
Kromatografi kertas sangat berguna untuk pemisahan zat anorganik, organic dan biokimia dalam jumlah yang sedikit. Sebagai fasa diam umumnya air yang terserap oleh pori-pori kertas. Oleh Karena itu fasa diam bersifat sedikit polar. Bila diinginkan fasa diam yang lain, maka biasanya kertas akan dikeringkan, kemudian menggunakan fasa diam seperti glikol, alcohol dll. Jika kertas dilapisi dengan zat-zat hidrofobik maka kromatografi yang dilakukan adalah kromatografi fasa terbalik ( reversed-phase-chromatography). System ini berguna untuk pemisahan asam-asam lemak, dan senyawa-senyawa non polar lainnya, yang mungkin akan terelusi terlalu cepat jika digunakan fasa diam polar kelarutannya yang rendah.