Kromatografi Afinitas

Pemurnian enzim atau protein menggunakan teknik kromatografi afinitas pada saat ini sangat populer dan menjadi pilihan utama. Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim atau protein terhadap biomolekul lain (ligan), misalnya enzim terhadap inhibitor, substrat atau produknya, afinitas antibodi terhadap antigennya, atau afinitas hormon terhadap reseptornya

Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi, dalam kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik²⁾.

Tujuan dari afinitas kromatografi adalah untuk memisahkan semua molekul dari kekhususan tertentu dari keseluruhan seluruh molekul dalam campuran

Pemurnian dengan teknik kromatografi afinitas disebut pemurnian satu tahap (one step purification) Dalam proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas diperlukan interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan.

Dalam kasus ini. pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks'2'.
Skema yang paling urnum untuk melakukan krmatografi afinitas adalah dengan melakukan tahap elusi gradien Skema ini melibatkan injeksi sampel ke dalam kolom afinitas dengan adanya fase gerak (dengan pH yang tepat) dan komposisi pelarut untuk ikatan solut-ligan. Pelarut ini, yang menggambarkan fase geraklemah pada kolom afinitas, disebut dengan bufer aplikasi. Selama fase aplikasi pemisahan, senyawa-senyawa yang komplemen dengan ligan afinitas akan berikatan karena sampel dilewatkan kolom dengan bufer aplikasi. Meskipun demikian, karena selektifitas interaksi solut-Iigan yang tinggi, sampel-sampel lain yang tidak terikat akan melewati kolom tanpa tertahan. Setelah komponen-komponen yang tidak t'ertahan telah tercuci secara sempurna dari kolom, solut yang tertahan dapat dielusi dengan menggunakan pelarut yang mampu mengeluarkannya dari kolom atau yang mampu memecah kompleks ligan-solut. Pelarut ini merupakan fase gerak yang kuat dan seringkali dikenal sebagai bufer elusi. Begitu solut yang dikehendaki keluar dari kolom, maka solut dapat diukur atau dikumpulkan untuk penggunaan lebih lanjut. Kolom selanjutnya diiregenerasi dengan cara mensetimbangkan kembali menggunakan bufer aplikasi sebelum injeksi lanjut

Komplementer molekul yang mengikat (ligan) pertama kovalen digabungkan ke larut matriks, seperti kecil agarosa manik-manik, dan matriks dituangkan ke dalam kolom. Suatu campuran tidak murni mengandung protein untuk diisolasi ini kemudian diterapkan pada kolom dan memungkinkan untuk berinteraksi dengan ligan amobil Pada tahap ini, protein yang akan diisolasi mengikat secara khusus untuk ligan amobil sementara sisa molekul dalam aliran campuran melalui kolom. Protein kepentingan kemudian dapat dielusi dari kolom di bawah kondisi yang mengganggu interaksinya dengan ligan

bufer pengelusi mengandung zat yang berfungsi untuk memutuskan ikatan antara protein yang akan diambil dengan lingannya. Jadi, buffer pengelusi ini dapat berkompetisi tempat dengan ligan terikat, sehingga protein lepas dan selanjutnya keluar bersama eluen.

Munculnya puncak pada grafik serapan fraksi-fraksi protein hasil pemurnian tergantung pada bufer pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan ikatan antara ligan dengan protein, maka akan terjadi tailing, yaitu puncak yang melebar. Selain itu, volume matriks juga mempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan yang ada semakin banyak. Jadi, semakin besar volume matriks semakin lebar puncak serapan, sehingga protein yang dihasilkan lebih banyak

Bahan terisolasi oleh Kromatografi Affinity dan Ligan komplementer

Zat Terisolasi oleh Afinitas Ligan

Chromatography Kromatografi

Enzim Substrat, kofaktor

Antibodi Antigen, Virus, Cell

Polisakarida, glikoprotein Lektin

Mengikat protein asam nukleat Asam Nukleat

Hormon reseptor Hormon

Keterbatasan metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi secara spesifik dengan suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat berinteraksi secara spesifik maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap. Namun Keterbatasan ini sekarang dapat diatasi dengan adanya teknologi fusi protein. Idenya adalah membuat suatu protein fusi yang terdiri dari protein yang akan dimurnikan dengan protein yang diketahui dapat berikatan spesifik dengan ligan tertentu.

Afinitas Kromatografi Metode

Kromatografi afinitas dirancang untuk memurnikan protein tertentu dari sampel campuran.

Di siapkan kolom afinitas dengan matriks dan ligan yang sesuai

Sampel Protein dimasukkan k kolom dan protein akan melalui saringan matriks afinitas manik-manik.

Protein berinteraksi dengan afinitas ligan dengan beberapa protein yang mengikat dengan erat, longgar dan tak berikatan

Protein yang tidak mengikat akan tercuci oleh buffer aplikasi.

protein yang mengikat di cuci dengan buffer elusi.

protein elusi yang mengikat erat ligan dan mengumpulkan protein murni penting